Test IgM SARS-CoV-2: Access

Il documento introduce i test sierologici Access SARS-CoV-2, specificamente per la determinazione degli anticorpi IgM e IgG anti-SARS-CoV-2. Questi test, da utilizzare in vitro, rappresentano un ausilio diagnostico per l'infezione da SARS-CoV-2, aiutando a identificare pazienti con risposta immunitaria adattativa, indicando infezioni recenti o pregresse. L'importanza dei test sierologici nella sorveglianza COVID-19 è evidenziata, considerando la significativa presenza di casi asintomatici o paucisintomatici. I risultati dei test forniscono informazioni cruciali per la gestione clinica dei pazienti, sia durante che dopo l'infezione. Si sottolinea però la necessità di integrare i risultati dei test sierologici con l'analisi del quadro clinico del paziente e altri test di laboratorio; i risultati non devono essere la sola base per la diagnosi. Il documento evidenzia l'uso di questi test per monitorare la diffusione della malattia e per valutare l'immunità, ipotizzando una potenziale protezione correlata alla presenza di anticorpi. La menzione del marchio commerciale ProClin™ di Dow Chemical Company indica un possibile produttore o fornitore di componenti del test.

La metodologia utilizzata per entrambi i test (IgM e IgG) è immunometrica, basata su un principio di immunocattura a due fasi. Per il test IgM, un campione prediluito viene aggiunto a una cuvetta contenente particelle paramagnetiche rivestite con anticorpi IgM anti-umano. Le IgM presenti nel campione vengono catturate. Dopo l'incubazione e la rimozione del materiale non legato, viene aggiunto un coniugato di fosfatasi alcalina legato a una proteina SARS-CoV-2 ricombinante (contenente il dominio di legame al recettore RBD della proteina S1). Questo coniugato si lega alle IgM anti-SARS-CoV-2 catturate. Successivamente, un substrato chemiluminescente genera luce, misurata da un luminometro; l'intensità luminosa è proporzionale alla concentrazione di IgM anti-SARS-CoV-2. Il processo per il test IgG è simile, ma impiega particelle paramagnetiche rivestite con la proteina SARS-CoV-2 ricombinante (RBD) per catturare le IgG anti-SARS-CoV-2, seguendo poi le stesse fasi di incubazione, lavaggio e misurazione della chemiluminescenza.

Il documento presenta i risultati degli studi sulla sensibilità e specificità clinica di entrambi i test. Per il test IgM, la sensibilità è stata valutata su 251 campioni (siero e plasma) di pazienti sintomatici con diagnosi di SARS-CoV-2 tramite PCR, provenienti da Francia e Stati Uniti. La specificità clinica è stata determinata su 1400 campioni raccolti prima del Dicembre 2019, includendo campioni da donatori di sangue francesi e campioni da laboratori clinici di routine in Francia e negli Stati Uniti. Sono presentati dati specifici di sensibilità e specificità, calcolati con il metodo del punteggio di Wilson. Per il test IgG, uno studio simile valuta la sensibilità su 181 campioni, sempre da pazienti sintomatici con diagnosi PCR-positiva. Anche per il test IgG, si evidenziano dati di sensibilità con intervalli di confidenza al 95%. In entrambi i casi, vengono analizzate possibili interferenze da alte concentrazioni di componenti sierici endogeni, seguendo le linee guida CLSI. I risultati suggeriscono una minima o assente interferenza significativa per entrambi i test.

L'importanza del controllo di qualità (QC) è sottolineata, raccomandando l'utilizzo di materiali QC Access SARS-CoV-2 IgM e IgG per validare l'integrità dei test. Ogni laboratorio deve stabilire i propri valori medi e intervalli di accettabilità. La tracciabilità dell'analita nel QC Access SARS-CoV-2 IgM segue la normativa EN ISO 17511. Per quanto riguarda l'interpretazione dei risultati, il documento sottolinea che i risultati dei test vengono determinati automaticamente dal software del sistema, con l'unità di misura predefinita di S/CO per IgM e IU/mL per IgG. È cruciale ricordare che i risultati dei test non devono essere utilizzati come unica base per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 e che devono essere interpretati nel contesto del quadro clinico completo del paziente, includendo sintomatologia, anamnesi e altri esami. Risultati positivi potrebbero non indicare necessariamente un'infezione pregressa da SARS-CoV-2 e possono essere influenzati da altri coronavirus.

Il dosaggio Access SARS-CoV-2 IgM è un test immunometrico a due fasi basato sull'immunocattura. Inizia con l'aggiunta di un campione paziente prediluito a una cuvetta contenente particelle paramagnetiche rivestite con un anticorpo IgM anti-umano monoclonale di ratto. Queste particelle catturano le IgM umane presenti nel campione. Dopo un'incubazione, il materiale legato viene trattenuto da un campo magnetico, mentre quello non legato viene eliminato. Segue l'aggiunta di un diluente del coniugato e del coniugato stesso, costituito da fosfatasi alcalina legata a una proteina SARS-CoV-2 ricombinante che include il dominio di legame al recettore (RBD) della proteina S1 virale. Questo coniugato si lega alle IgM anti-SARS-CoV-2 catturate precedentemente. Dopo una seconda incubazione e un lavaggio, si aggiunge un substrato chemiluminescente. La luce generata dalla reazione tra substrato e fosfatasi alcalina viene misurata da un luminometro. Confronto dell'intensità luminosa con un valore di cut-off determina la presenza o assenza di IgM anti-SARS-CoV-2 nel campione. Il processo è automatizzato e permette una lettura oggettiva dei risultati.

Il dosaggio Access SARS-CoV-2 IgG (1° IS) è anch'esso un dosaggio immunoenzimatico a due fasi. Un campione viene aggiunto a una cuvetta contenente un tampone e particelle paramagnetiche rivestite con proteina SARS-CoV-2 ricombinante specifica per il dominio di legame al recettore (RBD) della proteina S1. Dopo l'incubazione, il materiale legato viene trattenuto magneticamente, mentre il materiale non legato viene rimosso. A questo punto, viene aggiunto un coniugato di fosfatasi alcalina con un anticorpo monoclonale IgG anti-umano, che si lega agli anticorpi IgG catturati sulle particelle. Una seconda fase di separazione e lavaggio rimuove il coniugato non legato. Infine, si aggiunge il substrato chemiluminescente, e la luce generata dalla reazione viene misurata da un luminometro. La quantità di luce prodotta è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpo IgG SARS-CoV-2 nel campione, determinata tramite una curva di calibrazione a più punti memorizzata nel sistema. Questo metodo permette la quantificazione precisa degli anticorpi IgG anti-SARS-CoV-2.

La sensibilità e la specificità clinica dei test Access SARS-CoV-2 IgM e IgG sono state rigorosamente valutate. Per il test IgM, la sensibilità clinica è stata determinata su 251 campioni di siero e plasma provenienti da pazienti sintomatici con diagnosi di SARS-CoV-2 confermata da PCR, residenti in Francia e Stati Uniti. L'analisi, effettuata con il metodo del punteggio di Wilson, ha classificato i risultati in base ai giorni trascorsi tra il test PCR positivo e il prelievo del campione di sangue. La specificità clinica è stata valutata su 1400 campioni raccolti prima del dicembre 2019, suddivisi tra donatori di sangue francesi e campioni di diagnostica di routine da Francia e Stati Uniti, mostrando una specificità complessiva molto elevata. Per il test IgG, la sensibilità clinica è stata valutata su 181 campioni di plasma e siero di pazienti sintomatici con diagnosi PCR-positiva, con l'intervallo di confidenza al 95% determinato dal metodo del punteggio di Wilson. Questi dati dimostrano l'accuratezza dei test nel rilevare gli anticorpi IgM e IgG specifici per SARS-CoV-2, anche se l'interpretazione dei risultati deve essere integrata con altri dati clinici del paziente.

Il documento analizza le potenziali interferenze nei test, in particolare per alte concentrazioni di componenti sierici endogeni. Per entrambi i test (IgM e IgG), è stato condotto uno studio seguendo le linee guida CLSI EP07, valutando l'impatto di diverse sostanze su campioni positivi e negativi. I risultati indicano che nessuna delle sostanze testate ha causato interferenze significative, definite come variazioni di concentrazione superiori al 20%. Tuttavia, il documento evidenzia dei limiti importanti: i risultati non sono intercambiabili con quelli ottenuti da metodi di altri produttori e, nei dosaggi che impiegano anticorpi, si può verificare interferenza da anticorpi eterofili (come HAMA), potenzialmente causando risultati erronei nei pazienti con contatto regolare con animali o sottoposti a trattamenti con immunoglobuline. È fondamentale considerare che un risultato positivo non garantisce una precedente infezione da SARS-CoV-2 e che i risultati dei test non devono essere l'unico elemento per diagnosticare o escludere l'infezione. Infine, si ricorda che i risultati devono essere interpretati considerando il quadro clinico completo del paziente.

Per il test IgG, uno studio di imprecisone è stato condotto seguendo le linee guida CLSI EP05-A3, valutando la ripetibilità dei risultati utilizzando diversi lotti di reagenti e calibratori su tre strumenti Access 2. Il test ha dimostrato una linearità accettabile nell'intervallo di misurazione analitico compreso tra 8,00 IU/mL e 1.800 IU/mL, valutata secondo le linee guida CLSI EP06-A tramite diluizioni seriali di campioni a diversa concentrazione di IgG SARS-CoV-2. Per la sensibilità analitica, sono stati condotti studi sul limite del bianco (LoB), limite di rilevazione (LoD) e limite di quantificazione (LoQ) sul sistema UniCel DxI 800, seguendo le linee guida CLSI EP17-A2. Questi studi hanno coinvolto l'analisi di campioni di bianco e campioni a bassa concentrazione, su diversi lotti di reagenti e strumenti, per definire la capacità del test di rilevare anche quantità minime di analita. Questi dati contribuiscono a definire l'affidabilità e la precisione del test nel misurare la concentrazione di anticorpi.

Il documento sottolinea fortemente l'importanza dei materiali di controllo di qualità (QC) per garantire l'affidabilità dei risultati dei test Access SARS-CoV-2 IgM e IgG. Questi materiali, che simulano le caratteristiche dei campioni dei pazienti, sono essenziali per il monitoraggio delle prestazioni del sistema e sono parte integrante delle buone pratiche di laboratorio. L'utilizzo di QC Access SARS-CoV-2 IgM (per il test IgM) o QC Access SARS-CoV-2 IgG (1° IS) (per il test IgG), o di altri materiali commercialmente disponibili, è raccomandato per validare l'integrità di ogni dosaggio. Il documento specifica che i controlli devono coprire almeno due livelli di analita e suggerisce che l'uso più frequente di controlli, oltre a quelli previsti, è lasciato alla discrezione dell'operatore, in linea con le buone pratiche di laboratorio o i requisiti di accreditamento. I risultati del controllo di qualità che cadono fuori dagli intervalli accettabili indicano potenziali problemi e invalidano i risultati dei test dei pazienti. Ogni laboratorio deve stabilire i propri valori medi e intervalli di accettabilità per assicurare prestazioni ottimali.

La tracciabilità dell'analita nei materiali QC Access SARS-CoV-2 IgM e IgG è garantita. Per il test IgM, l'analita è tracciabile secondo i parametri dei calibratori operativi del produttore, basandosi sulla normativa EN ISO 17511. I valori attribuiti sono specifici per le metodologie di dosaggio dei reagenti Access; valori ottenuti con altre metodologie potrebbero differire a causa di possibili distorsioni inter-metodo. Per il test IgG, il processo è simile, con l'obiettivo di fornire valori affidabili e confrontabili all'interno del sistema Access. Il documento sottolinea la necessità di selezionare e analizzare campioni rappresentativi di ogni lotto di QC per ottenere una stima affidabile del valore medio. Questi valori medi e le deviazioni standard sono forniti, ma ogni laboratorio è tenuto a stabilire i propri valori medi e deviazioni standard (SD), dato che variazioni di tecnica, apparecchiatura o reagenti possono influenzare i risultati. L'accuratezza e l'affidabilità del controllo di qualità sono cruciali per garantire la validità dei risultati dei test sui pazienti.