Telomeri e Citopenie: Studio Monocentrico

La sintesi del DNA sul filamento lento durante la replicazione avviene in modo discontinuo, generando corti frammenti di Okazaki. Questo meccanismo presenta una difficoltà all'estremità della forchetta replicativa: il primer di RNA finale non può essere sostituito da DNA, causando la perdita di una parte di DNA telomerico ad ogni divisione cellulare. Questo accorciamento progressivo dei telomeri, senza un meccanismo riparativo, comprometterebbe l'integrità dei cromosomi. La sequenza telomerica, costituita da ripetizioni a doppio filamento con una sporgenza a singolo filamento 3', viene riconosciuta da proteine che reclutano la telomerasi, enzima chiave per il mantenimento della lunghezza dei telomeri e la loro protezione. La sporgenza 3' funge da sito di priming per la telomerasi, formando anche una struttura protettiva, il t-loop, che sembra prevenire il segnale di danno del DNA.

La telomerasi viene reclutata ai telomeri grazie a TPP1, parte del complesso Shelterin. TPP1, in associazione con POT1, stimola l'attività della telomerasi in vitro. Si ipotizza che TPP1 interagisca con il DNA o con la trascrittasi inversa (TR) per facilitare la traslocazione del sito catalitico della telomerasi. L'interazione tra TPP1 e la telomerasi, in particolare attraverso la regione TEL, è essenziale per il mantenimento della lunghezza dei telomeri; cellule prive di questa interazione mostrano un accorciamento progressivo dei telomeri fino alla loro completa scomparsa. Una mutazione di POT1 che impedisce il legame con il ssDNA porta a una completa perdita del controllo sulla lunghezza dei telomeri. Il complesso CST (CTC1, STN1, TEN1) ha invece un ruolo inibitorio sulla telomerasi, determinando il limite massimo dell'allungamento del telomero. Questo complesso lega il DNA a singolo filamento e sposta la telomerasi, inattivandola, quando la sporgenza 3' del telomero raggiunge una lunghezza specifica.

Nei tessuti differenziati (esclusi i linfociti), l'attività della telomerasi è ridotta o assente, causando una perdita di 50-100 paia di basi ad ogni divisione cellulare. L’accorciamento dei telomeri è quindi una conseguenza normale dell'invecchiamento. Ad esempio, nei linfociti la lunghezza media dei telomeri diminuisce da circa 11 kb alla nascita a 4 kb nei centenari. Questa progressiva riduzione ha portato a definire i telomeri come 'l'orologio biologico' interno alla cellula. La lunghezza del telomero alla nascita è altamente variabile, coerente con la variabilità osservata negli embrioni umani e sembra associata alla lunghezza dei telomeri dei genitori. La lunghezza rimane simile nei diversi tessuti alla nascita, senza differenze significative tra maschi e femmine, a differenza di quanto osservato negli adulti, dove le lunghezze variano tra i tessuti e sono generalmente maggiori nelle donne. L'accorciamento dei telomeri è in parte compensato dall'attività della telomerasi, espressa in tessuti ad alta replicazione come cellule staminali, cellule germinali e linfociti attivati.

L'esaurimento delle cellule staminali ematopoietiche (CSE) e dei linfociti, dovuto a un'attività ridotta della telomerasi, potrebbe essere alla base dell'insufficienza midollare osservata nei pazienti pediatrici con deficit di telomerasi. Un numero sufficiente di cellule staminali conservate fino all'età adulta potrebbe causare un esaurimento delle cellule del sistema immunitario. Ciò è supportato dall'osservazione di un accorciamento più marcato dei telomeri nei linfociti T maturi e nelle cellule NK dopo la pubertà, rispetto ai granulociti. Il 'cappuccio' protettivo mancante nei telomeri delle cellule con attività telomerasica ridotta può influenzare la lunghezza dei telomeri in modo diretto (replicazione del DNA telomerico, danno da specie reattive dell'ossigeno) e indiretto (aumento delle divisioni cellulari compensatorie, che ulteriormente accorciano i telomeri).

Le telomeropatie sono un gruppo di patologie caratterizzate da un accorciamento prematuro dei telomeri, dovuto a mutazioni genetiche che compromettono il meccanismo di mantenimento della loro lunghezza. Questo accorciamento porta a una insufficienza proliferativa dei tessuti coinvolti, manifestandosi con una gamma di sintomi e severità variabili, da forme lievi a molto gravi, anche all'interno della stessa variante genetica. La velocità di accorciamento dei telomeri nelle telomeropatie è significativamente maggiore rispetto a quella degli individui sani (circa 120 paia di basi/anno contro 60). La diagnosi viene spesso posta in età adulta, ma l'insorgenza può variare dalla nascita all'età adulta, con una correlazione diretta tra gravità della malattia e lunghezza dei telomeri: telomeri più corti corrispondono a malattie più gravi e ad esordio precoce. Le malattie dei telomeri presentano fenotipi molto variabili, con differenze nella penetranza e nell'età di esordio, rendendo la diagnosi spesso subdola e inaspettata.

Le mutazioni che causano le telomeropatie possono interessare diversi geni. Le mutazioni più comuni riguardano TERT e TERC, geni coinvolti nell'attività catalitica della telomerasi. Mutazioni in altri geni influenzano la biogenesi della telomerasi e la stabilità dell'hTR, come DKC1, NHP2 e NOP10. Anche mutazioni che alterano il reclutamento della telomerasi al telomero, come quelle del gene TCAB1, sono coinvolte. La carenza di TCAB1, ad esempio, causa una relocalizzazione della telomerasi dai corpi di Cajal al nucleolo, riducendo il reclutamento della telomerasi e causando accorciamento telomerico. Altre mutazioni, come quelle di TINF2 (che codifica per TIN2), causano un accorciamento severo dei telomeri con patologie ad esordio precoce, come la sindrome di Hoyeraal-Hreidarsson e di Revesz. Un gene di recente scoperta associato alle telomeropatie è PARN. Le mutazioni di TERC sembrano determinare fenotipi più severi rispetto a quelle di TERT, almeno in vitro. La perdita di funzione di uno dei due geni autosomici TERC o TERT è sufficiente a ridurre l'attività della telomerasi e ad accelerare l'accorciamento dei telomeri.

La discheratosi congenita (DC) è una telomeropatia X-linked, tipicamente caratterizzata da una triade di sintomi: distrofia ungueale, leucoplachia e iperpigmentazione cutanea. A questi sintomi possono associarsi insufficienza midollare e il coinvolgimento di altri organi (polmoni, fegato, sistema genito-urinario, scheletro), con una maggiore predisposizione allo sviluppo di neoplasie. Il primo gene mutato identificato nella DC è DKC1, che codifica per la discherina. Studi hanno dimostrato che la lunghezza del telomero inferiore al primo percentile nei linfociti totali, T naive e B ha una sensibilità e specificità superiore al 90% per la diagnosi di DC, mentre l'analisi sui granulociti è meno specifica. La combinazione di risultati inferiori al primo percentile in almeno tre o quattro sottopopolazioni cellulari (linfociti totali, T memory, T naive e B) aumenta la sensibilità e specificità diagnostica (94% e 98%). Un accorciamento eccessivo dei telomeri nella DC porta ad apoptosi, riducendo l'emopoiesi e la vita delle cellule somatiche, con conseguente instabilità cromosomica e predisposizione alle neoplasie.

Diversi studi hanno valutato la lunghezza dei telomeri in pazienti affetti da insufficienze midollari su base genetica, come l'anemia di Fanconi (FA), l'anemia di Diamond Blackfan (DBA) e la sindrome di Schwachman-Diamond (SDS). In questi casi, si rileva spesso una lunghezza media dei telomeri inferiore rispetto ai controlli sani della stessa età. Questa osservazione è interpretata come conseguenza di un anomalo turnover dei progenitori midollari, con un aumento dell'apoptosi correlato ai meccanismi patogenetici delle diverse condizioni. Nell'anemia di Fanconi, ad esempio, l'attività della telomerasi è conservata, suggerendo che l'accorciamento dei telomeri sia secondario alla perdita di nucleotidi telomerici dovuta all'aumentata proliferazione cellulare midollare in risposta alla pancitopenia, oppure a un danno telomerico diretto o mediato da specie reattive dell'ossigeno che la cellula FA non riesce a riparare. Studi recenti ipotizzano anche un ruolo diretto di alcune proteine FA nel mantenimento dell'omeostasi telomerica. Nella sindrome di Schwachman-Diamond, il meccanismo sembra simile a quello dell'anemia di Fanconi, con un maggiore stress replicativo e una maggiore spinta proliferativa compensatoria dei progenitori midollari che causano l'accorciamento telomerico, nonostante un'attività della telomerasi normale.

Negli studi condotti, la lunghezza dei telomeri inferiore al primo percentile veniva evidenziata soprattutto nei granulociti, linea cellulare considerata a bassa specificità per la diagnosi di discheratosi congenita. Questo dato è spiegabile con l'aumentato turnover cellulare delle cellule staminali ematopoietiche (CSE), responsabile dell'accorciamento dei telomeri nei pazienti con insufficienze midollari non associate alla discheratosi congenita. Solo una piccola percentuale di pazienti con DBA, FA e SDS presentava una lunghezza del telomero inferiore al primo percentile in più sottopopolazioni cellulari (linfociti totali, T naive, T memory e B), parametro considerato più sensibile e specifico per la diagnosi di discheratosi congenita. Uno studio del 2001 di Brümmendorf ha evidenziato un accorciamento dei telomeri nel 30-50% dei leucociti di pazienti con anemia aplastica (AA), in particolare nei granulociti, con lunghezza dei telomeri sovrapponibile ai controlli nei pazienti responsivi alla terapia immunosoppressiva. Questo indica una potenziale correlazione tra risposta al trattamento e lunghezza dei telomeri.

Studi recenti hanno indagato il ruolo del complesso telomero/telomerasi nelle malattie autoimmuni, evidenziando un accorciamento dei telomeri nelle cellule mononucleate del sangue periferico di pazienti affetti da diverse patologie, tra cui lupus eritematoso sistemico, artrite reumatoide, malattie granulomatose (come la granulomatosi di Wegener e la sarcoidosi), sclerosi sistemica, fibrosi polmonare idiopatica, cirrosi biliare primitiva e diabete di tipo 1. Questo accorciamento telomerico è probabilmente correlato a una triade di fattori: infiammazione, stress ossidativo e aumentato turnover leucocitario. In alcune condizioni, potrebbe contribuire anche una ridotta attività della telomerasi, anche se i dati in letteratura sono ancora controversi; in alcune malattie autoimmuni, come il LES o l'artrite reumatoide, è stata addirittura osservata un'attività telomerasica aumentata. La comprensione del ruolo dei telomeri e della telomerasi nella patogenesi delle malattie autoimmuni è un campo di ricerca in continua evoluzione.

Si ipotizza che l'attività della telomerasi sia fondamentale per il mantenimento del potenziale replicativo dei linfociti T, in particolare delle cellule T memoria nell'adulto, con l'attivazione del recettore dei linfociti T (TCR) che aumenta l'attività della telomerasi. L'immunodeficienza può essere il primo sintomo di una telomeropatia, in assenza di altre manifestazioni cliniche. Le mutazioni legate alle malattie del telomero e della telomerasi sono annoverate tra le cause di immunodeficienza primaria. È quindi cruciale valutare la lunghezza dei telomeri in questi pazienti, poiché presentano una maggiore suscettibilità alla tossicità delle terapie convenzionali, come i protocolli mieloablativi per il trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Regimi di condizionamento a bassa intensità possono proteggere questi pazienti dai danni al DNA. Le disfunzioni del telomero sono state associate a una prognosi peggiore nella leucemia linfatica cronica, con telomeri corti correlati ad alterazioni genomiche ad alto rischio. Uno studio su pazienti con leucemia linfoide acuta (LAL) ha dimostrato un accorciamento significativo dei telomeri rispetto a un gruppo di controllo, ma non sono state trovate associazioni tra polimorfismi di hTERT e il rischio di LAL o le sue caratteristiche cliniche.

La misurazione della lunghezza dei telomeri è fondamentale per la diagnosi e la comprensione delle telomeropatie. Il documento menziona la tecnica Flow-FISH, che permette di analizzare la lunghezza dei telomeri in diverse sottopopolazioni cellulari da un singolo campione di sangue. Questa tecnica, sebbene utile per studiare la lunghezza telomerica media nelle cellule del sangue, presenta dei limiti: a basse concentrazioni di sequenze telomeriche, i segnali di fluorescenza non vengono captati, e la sonda può legarsi a sequenze telomeriche interstiziali, causando falsi positivi. Altri metodi, come STELA, permettono un monitoraggio più preciso dei cambiamenti di lunghezza telomerica nel tempo, ma presentano una minore efficienza e non misurano i telomeri più lunghi. Lo studio della lunghezza telomerica nelle cellule staminali ematopoietiche (CSE) è complicato dalla loro localizzazione nel midollo osseo; per questo, la lunghezza dei telomeri nei granulociti viene spesso usata come surrogato di quella nelle CSE. Nel caso specifico dello studio descritto, l'analisi flow-FISH è stata condotta su linfociti e granulociti, con e senza marcatura specifica per il DNA telomerico (PNA marcato con FITC), per correggere l'autofluorescenza delle cellule. La lunghezza dei telomeri è stata quindi espressa in unità MESF (molecules of equivalent soluble fluorochrome) e convertita in paia di basi.

Lo studio ha coinvolto una coorte di pazienti con citopenie di diversa origine, con l'obiettivo di valutare la correlazione tra la lunghezza dei telomeri, il fenotipo clinico e le mutazioni genetiche. I pazienti sono stati divisi in tre gruppi in base alla lunghezza dei telomeri: gruppo 1 (telomeri normali), gruppo 2 (telomeri inferiori al quinto percentile) e gruppo 3 (telomeri inferiori al primo percentile). È stato utilizzato uno score di severità per le anomalie fenotipiche, mutuato da uno studio del 2016 di Svahn et al., che assegnava un punteggio in base alla gravità delle malformazioni. L'analisi ha mostrato una maggiore frequenza di fenotipi anomali, fenotipo di discheratosi congenita e citopenia nei pazienti con telomeri inferiori al quinto percentile, anche se le differenze non erano statisticamente significative tranne che per il fenotipo discheratosi. Il gruppo con telomeri inferiori al primo percentile presentava significativamente più stimmate di discheratosi congenita rispetto agli altri gruppi. L'analisi NGS su pazienti con telomeri inferiori al primo percentile ha rivelato mutazioni in geni associati alle malattie del telomero in una percentuale significativamente maggiore rispetto al gruppo con telomeri normali, in particolare mutazioni in geni correlati alla discheratosi congenita.

Lo studio ha dimostrato che la lunghezza del telomero inferiore al quinto percentile è associata a una maggiore frequenza di fenotipo anomalo e di discheratosi congenita. La citopenia, pur essendo un criterio di inclusione, non ha differenziato significativamente i gruppi. L'analisi di concordanza (indice Kappa di Cohen) ha evidenziato una significativa associazione tra la lunghezza del telomero inferiore al primo percentile e la presenza di anomalie fenotipiche suggestive di discheratosi congenita. Lo studio ha evidenziato che la lunghezza dei telomeri non è predittiva della presenza di mutazioni in familiari senza insufficienza midollare, suggerendo l'esistenza di geni modificatori che potrebbero compensare l'accorciamento dei telomeri. NGS ha rivelato mutazioni nei geni delle malattie del telomero in 9 su 13 pazienti con telomeri sotto il primo percentile, con una frequenza significativamente maggiore rispetto al gruppo 1 (telomeri normali). Il punto di forza dello studio è l'analisi di una popolazione eterogenea di pazienti, consentendo la valutazione della lunghezza dei telomeri in pazienti con citopenie autoimmuni e/o immunodeficienze, un aspetto finora poco esplorato.

Il documento menziona il trapianto di cellule staminali emopoietiche come opzione terapeutica per i pazienti con telomeropatie severe, in particolare per la discheratosi congenita. Su 55 pazienti studiati, a 20 è stato indicato il trapianto, con diagnosi variabili che includevano anemia di Fanconi (1 caso), discheratosi congenita (3 casi), un caso sospetto di mutazione in geni che regolano l'espressione del DNA mitocondriale (genetica in corso), diverse immunodeficienze/disimmunità (mutazioni in PI3K/CASP10, LIG4, TACI, CARD11, BLNK+TCF3, SAMD9, GATA2, CTLA4) e 7 casi di anemia aplastica. La scelta del trapianto è stata fatta indipendentemente dalla lunghezza dei telomeri, suggerendo che altri fattori clinici siano decisivi per questa scelta terapeutica. L'analisi dei dati non ha mostrato differenze significative tra i gruppi, divisi in base alla lunghezza dei telomeri, riguardo al fenotipo o alla gravità della citopenia, sebbene il punteggio fenotipico sia risultato tendenzialmente più alterato e grave nel gruppo 1 (telomeri normali), anche se non statisticamente significativo. Questo dato sottolinea la complessità della correlazione tra lunghezza dei telomeri, fenotipo clinico e risposta alla terapia.

Lo studio ha evidenziato una significativa correlazione tra la presenza di un fenotipo di discheratosi congenita e un grave accorciamento dei telomeri (p=0,04), suggerendo che questo fenotipo possa essere considerato un indicatore per l'esecuzione dell'esame per la lunghezza dei telomeri. La citopenia, pur essendo più frequentemente grave nel gruppo con telomeri corti, non ha differenziato significativamente i gruppi, data la sua inclusione come criterio di selezione dei pazienti. La lunghezza dei telomeri nei familiari senza insufficienza midollare non è predittiva della presenza di mutazioni genetiche: sono stati descritti casi di familiari di pazienti con discheratosi congenita che presentano telomeri corti ma non la mutazione, e viceversa, pazienti con lunghezza telomerica normale e fenotipo normale ma portatori della mutazione. Questo indica la possibile influenza di geni modificatori o l'insufficienza della mutazione da sola a causare la patologia. L'analisi NGS ha confermato una significativa associazione tra la lunghezza del telomero inferiore al primo percentile e la presenza di mutazioni nei geni della discheratosi congenita (p=0,0009).

Lo studio ha evidenziato l'importanza della valutazione della lunghezza dei telomeri nella diagnosi e nella gestione di pazienti con citopenie di diversa origine, in particolare quando sono presenti caratteristiche cliniche suggestive di discheratosi congenita. La lunghezza del telomero si conferma come un parametro diagnostico utile, anche se non predittivo in tutti i casi. L'analisi di una popolazione eterogenea di pazienti rappresenta un punto di forza dello studio, consentendo di investigare la lunghezza dei telomeri in condizioni cliniche diverse e finora poco studiate, come le citopenie autoimmuni e/o da immunodeficienza. Ulteriori studi sono necessari per approfondire i meccanismi patogenetici delle diverse telomeropatie e per sviluppare nuove terapie mirate.