Analisi LC-MS aerosol atmosferico

La sezione introduce il concetto di inquinamento atmosferico come un insieme di agenti chimici, fisici e biologici che alterano l'atmosfera, derivanti sia da fonti naturali che antropiche. I cambiamenti climatici e le conseguenze sulla salute umana hanno motivato lo studio. Viene definito l'aerosol atmosferico come una sospensione di materiale solido o liquido a bassa velocità di sedimentazione in un mezzo gassoso. Le particelle hanno dimensioni e forme variabili, classificate in base al diametro aerodinamico equivalente (dae). La frazione fine (0.1-2.5 µm) si forma per coagulazione di particelle ultrafini e processi di conversione gas-particella, con costituenti principali come solfati, nitrati, ione ammonio e carbonio organico ed elementi biologici. Queste particelle hanno un lungo tempo di residenza atmosferico e possono essere trasportate a lunghe distanze. La frazione coarse (aerosol primario) è immessa direttamente in atmosfera da fonti naturali (es. sabbia, spray marino, pollini, attività vulcanica) o antropiche (es. combustione di biomassa), sedimentando rapidamente per gravità.

Il particolato atmosferico contiene solfati, nitrati, ammonio, materiali organici, specie crostali, sali marini, ioni idrogeno e acqua. Solfati, ammonio, carbonio organico e metalli di transizione sono più concentrati nelle particelle fini, prevalentemente legate a fonti secondarie (Marconi A., 2003). La composizione chimica dipende dall'area di provenienza e dalle sorgenti di emissione, con le particelle trasportate a grandi distanze influenzando la qualità dell'aria anche in zone lontane dalle fonti locali (Marconi A., 2003). L'aerosol atmosferico influisce sul microclima urbano, contribuendo all'effetto 'isola di calore' e riducendo la radiazione solare che raggiunge il suolo (fino al 15%). La tossicità dell'aerosol dipende dalla distribuzione dimensionale e dalla composizione, in particolare dalla presenza di solfati, nitrati, sostanze acide ed elementi in traccia (metalli pesanti).

Lo studio si concentra su composti idrofobici e idrofilici, con particolare attenzione alla frazione organica idrofilica che influenza l'igroscopicità e l'attività dei nuclei di condensazione delle nuvole (Michihiro Mochida, 2006). L'analisi dei metossifenoli, prodotti di combustione della legna, e degli acidi grassi come potenziali tensioattivi permette di studiare le fonti di emissione e le modalità di trasporto dell'aerosol. Il tempo di vita medio dei metossifenoli in atmosfera (1.7-8.1 ore, Coeur–Tourneur et al., 2010) ne limita l'utilità come traccianti. La ricerca SAFARI (Southern African Fire-Atmosphere Research Initiative) ha combinato l'analisi chimica degli acidi grassi con lo studio delle traiettorie delle masse d'aria per comprendere meglio le fonti dell'aerosol e il suo trasporto (Kaycie A., 2003). Uno studio sulle coste asiatiche ha evidenziato l'utilizzo degli acidi grassi (C20-C30) come indicatori di combustione di biomassa (acido tetracosanoico C24:0) e di origine marina (acido palmitico) (Michihiro M., 2006).

L'analisi si basa su un sistema di HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) accoppiato ad uno spettrometro di massa ad altissima risoluzione LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Questa combinazione permette un'analisi quantitativa e qualitativa degli analiti, ottenendo informazioni sia dal punto di vista quantitativo (analisi degli analiti) che qualitativo (trattamento dei dati in full scan ad alta risoluzione). La tecnica LC/MS offre il vantaggio di evitare procedure di derivatizzazione degli analiti, riducendo i tempi di analisi e il rischio di contaminazione. L'ionizzazione electrospray (ESI) è utilizzata come tecnica di ionizzazione. Il documento descrive dettagliatamente il funzionamento dell'ESI, incluso il meccanismo di elettronebulizzazione per convertire gli ioni in soluzione in ioni in fase gassosa, particolarmente adatto a composti polari, macromolecole (proteine, peptidi) e piccole molecole, grazie alla formazione di ioni multicarica. Vengono descritti i componenti dell'interfaccia della sorgente ionica, tra cui l'ion swipe cone, lo spray cone, e l'ion transfer capillary, il tutto funzionante sotto vuoto per ottimizzare il processo di ionizzazione e trasferimento degli ioni allo spettrometro di massa.

Lo sviluppo del metodo cromatografico implica la scelta della colonna cromatografica (in base all'interazione tra analiti e fase stazionaria) e della fase mobile. L'eluizione può essere isocratica o in gradiente per ottenere la migliore separazione degli analiti. L'obiettivo è raggiungere la maggiore risoluzione ed efficienza, caratterizzate da picchi ben separati, stretti e di elevata intensità. Per la determinazione dei metossifenoli, sono state valutate tre colonne cromatografiche: Poroshell 120 SB-C18, Eclipse e Extend C18, scegliendo le prime due per la loro maggiore efficienza. La colonna Extend C18 è stata scartata a causa della scarsa efficienza e del flusso maggiore richiesto (500 µL min-1), che portava a una maggiore diluizione dell'analita e conseguente riduzione di sensibilità. Per gli acidi grassi, sono state valutate le colonne XBridge Shield RP18, Poroshell 120 SB-C18, Kinetex C18, Eclipse e Extend C18. Il metodo di quantificazione impiegato è quello dello standard interno, che permette di correggere eventuali imprecisioni strumentali o errori nella preparazione dei campioni.

L'ottimizzazione delle condizioni strumentali della sorgente ionica dello spettrometro di massa è stata effettuata mediante tunaggio, effettuato per infusione diretta utilizzando una pompa a siringa integrata (flusso di 10 µL min-1). Le condizioni migliori di tunaggio sono state valutate per ogni analita per ottenere la massima sensibilità, scegliendo poi un setting comune per tutti gli analiti, con una finestra aggiuntiva per l'acido p-cumarico. Per la quantificazione dei metossifenoli, è stato utilizzato il metodo dello standard interno con la vanillina marcata. I risultati sono stati corretti utilizzando il fattore di risposta strumentale. La validazione del metodo ha incluso la valutazione della linearità (retta di calibrazione), l'analisi dei bianchi procedurali, il calcolo del LOD (limite di detezione), LOQ (limite di quantificazione), della resa, precisione (ripetibilità) e accuratezza. L'utilizzo di uno standard interno con un solo atomo di 13C si è rivelato problematico a causa dell'interferenza con l'abbondanza isotopica naturale, portando alla necessità di utilizzare standard interni marcati con un numero maggiore di isotopi di 13C per analisi in full scan con l'Orbitrap.

L'analisi dei metossifenoli, marcatori di combustione di legna, ha rivelato che il riscaldamento domestico con legna di tipo hardwood è la principale fonte di questi composti nell'atmosfera. I risultati ottenuti tramite HPLC-MS sono stati confrontati con quelli ottenuti da metodi tradizionali come la GC/MS, che richiedono lunghe procedure preanalitiche con derivatizzazione degli analiti, portando a rischi di perdita di analita, derivatizzazione incompleta e contaminazione. Il documento cita studi precedenti (Iinuma Y., 2007; Oros, D. R., 2006; Simpson, C. D., 2005; He, J., 2010; Orasche J., 2011) che hanno impiegato diverse tecniche, come la GC-TOFMS, per l'analisi dei metossifenoli. Lo studio evidenzia come l'approccio HPLC-MS usato offra una maggiore efficienza evitando la fase di derivatizzazione. Per completezza, sono stati inclusi anche i dati sulla concentrazione di IPA (idrocarburi policiclici aromatici) provenienti da un precedente lavoro di tesi (Senese D., 2011), ma la scarsità di dati ha impedito un'analisi approfondita delle correlazioni temporali tra metossifenoli e IPA.

L'analisi degli acidi grassi si concentra sulla loro funzione come biomarcatori per determinare l'origine e il trasporto dell'aerosol atmosferico. La scelta dell'utilizzo di tecniche HPLC accoppiate alla spettrometria di massa per l'analisi degli acidi grassi è giustificata dalla possibilità di evitare la derivatizzazione, necessaria in metodi come la Gas Cromatografia (GC) per migliorare la sensibilità e risolvere problemi di allargamento e scodatura dei picchi (Guoliang L., 2011). L'alta polarità degli acidi grassi rende possibile l'analisi diretta con HPLC-MS. Tuttavia, l'analisi ha riscontrato problemi di scarsa resa di ionizzazione, migliorata in polarità negativa con l'aggiunta post-colonna di una soluzione di ammonio idrossido. La contaminazione dei campioni è stata un'importante sfida analitica, influenzando la valutazione della resa e dell'accuratezza. Inoltre, la scarsa stabilità degli analiti, soprattutto degli acidi grassi insaturi (confermata da studi di letteratura, Jiasong F., 2002), ha causato una progressiva diminuzione dell'altezza dei picchi cromatografici, problema non risolto neanche con la refrigerazione dei campioni. Problemi di effetto memoria nell'autocampionatore sono stati risolti cambiando la soluzione di lavaggio dell'ago.