Analisi Aromi Vino: GC/MS e UHPLC/MS

Il profilo aromatico del vino, aspetto sensoriale di primaria importanza per la sua tipicità, è definito da un'ampia gamma di composti volatili. Questi composti possono essere suddivisi in due categorie principali: quelli derivanti direttamente dall'uva, costituenti la componente varietale, e quelli che si formano durante la fermentazione alcolica, definiti aromi di fermentazione. La componente varietale comprende sia i composti volatili liberi che i precursori aromatici glicosilati, la cui presenza è strettamente legata alla varietà di uva utilizzata e alle tecniche di coltivazione. Alcuni composti volatili sono studiati come marcatori di specifici caratteri organolettici, come nel caso dei vini prodotti da uve di ibridi produttori diretti, dove si è indagata la presenza di 4-idrossi-2,5-dimetil-3-furanone (furaneolo) e metil-2-aminobenzoato (metil antranilato) come indicatori caratteristici. L'analisi sensoriale del vino, quindi, è profondamente connessa alla composizione chimica del prodotto e alla presenza di specifiche molecole aromatiche.

Tra i composti volatili più importanti troviamo i norisoprenoidi, composti a 13 atomi di carbonio derivanti dalla degradazione ossidativa dei carotenoidi. Questi si suddividono in megastigmani e non megastigmani, entrambi contenenti diversi composti volatili. I megastigmani sono caratterizzati da un ciclo a sei atomi di carbonio e una catena alifatica insatura, spesso ossigenati sul carbonio C7 (serie damascenone) o C9 (serie ionone). Il β-damascenone, ad esempio, contribuisce a note complesse di fiori, frutti esotici e composta di mele, mentre il β-ionone dona l'odore di violetta. Altri norisoprenoidi importanti includono 3-oxo-α-ionolo (tabacco), 3-idrossi-β-damascone (tè e tabacco), e β-damascone (tabacco e fruttato). I non megastigmani comprendono composti molto odorosi, come il TDN (1,1,6-trimetil-1,2-diidronaftalene), responsabile dell'aroma di cherosene. Alcuni norisoprenoidi esistono in forma glicosilata e richiedono enzimi esogeni per l'idrolisi. Un'altra classe importante è quella degli alcanoli, principalmente composti a sei atomi di carbonio (esanoli ed esenoli) che contribuiscono ai sentori erbacei dell'uva poco matura. Questi derivano dalla lisi delle membrane cellulari o da processi metabolici variabili a seconda della varietà d'uva.

Vitigni nordamericani come Vitis lambrusca e Vitis rotundifolia, e i loro ibridi, sono noti per il caratteristico aroma definito 'volpino' o 'foxy'. Numerosi studi si sono concentrati sull'identificazione dei composti volatili responsabili di questo aroma. Il metil-2-aminobenzoato (metil antranilato) e il 4-idrossi-2,5-dimetil-3-furanone (furaneolo) sono considerati i principali marcatori per distinguere i vini da Vitis vinifera da quelli ottenuti da ibridi americani. Il metil antranilato, con una soglia di percezione di 100 µg/L, è prodotto dalla vite come protezione contro gli animali, il suo odore, simile al gelsomino, funziona come repellente. La concentrazione di metil antranilato nelle uve varia in base a diversi fattori, tra cui la maturazione, la macerazione delle bucce e la temperatura di fermentazione. La presenza di questi composti è dunque un indicatore chiave nella caratterizzazione aromatica dei vini da uve ibride, offrendo informazioni importanti sulla composizione e origine del prodotto.

La vite appartiene all'ordine delle Rhamnales, famiglia delle Vitacee o Ampelidaceae, suddivisa nelle sottofamiglie Lecoideae e Ampelideae. Quest'ultima comprende quattro generi, tra cui Vitis, che a sua volta include due sottogeneri: Muscadinia ed Euvitis. Il sottogenere Muscadinia comprende specie come Vitis rotundifolia, mentre il sottogenere Euvitis include la Vitis vinifera, detta anche vite europea, coltivata fin dall'antichità in Europa, Medio Oriente e Caucaso. Oltre alla Vitis vinifera, il sottogenere Euvitis comprende altre specie, prevalentemente selvatiche, di origine americana, come la Vitis labrusca, la Vitis riparia, la Vitis rupestris e la Vitis berlandieri. Queste specie americane, poco sensibili alla fillossera, sono utilizzate come portinnesti per le viti europee o per creare ibridi con varietà di Vitis vinifera. La Vitis vinifera rappresenta quindi la base per la maggior parte dei vini commerciali, mentre le specie americane e i loro ibridi hanno un ruolo più marginale nella produzione di vini destinati al commercio, a causa delle restrizioni imposte dalla legislazione comunitaria.

Le specie americane di vite, come la Vitis labrusca, e i loro ibridi con la Vitis vinifera, possono essere vinificate, sebbene la legislazione della Comunità Europea vieti la vinificazione per il commercio di uve provenienti da viti americane e dagli ibridi. Si ottengono così vini come il Fragolino o il Clinton, in passato più diffusi nel consumo locale di zone fredde e umide del Nord Italia. Questi vini, ottenuti da ibridi produttori diretti, sono caratterizzati da un aroma peculiare, definito 'volpino' o 'foxy', diverso da quello dei vini da Vitis vinifera. L'aroma 'foxy' è oggetto di studio per individuare i composti volatili responsabili della sua tipicità. Il metil-2-aminobenzoato (metil antranilato) e il 4-idrossi-2,5-dimetil-3-furanone (furaneolo) sono considerati i principali marcatori di questo aroma, consentendo di distinguere i vini ottenuti da ibridi da quelli di origine puramente europea. La presenza o l'assenza di questi composti è dunque fondamentale per la classificazione e la caratterizzazione dei diversi tipi di vino.

La sfogliatura è una pratica viticola che consiste nell'eliminare parte delle foglie nella zona dei grappoli. Tradizionalmente eseguita in pre-vendemmia per aumentare l'esposizione solare dei grappoli, favorendo l'accumulo di zuccheri e migliorando l'arieggiamento per ridurre l'incidenza di malattie fungine. Recentemente, la sfogliatura viene effettuata anche in pre-allegagione (inizio maggio) per diminuire il numero di acini nel grappolo, migliorando il microclima e la situazione sanitaria. Questo intervento stimola la crescita di nuove foglie apicali, aumentando la biosintesi di sostanze nutritive grazie alla maggiore attività fotosintetica delle foglie giovani. L'efficacia della sfogliatura come tecnica viticola è legata alla sua capacità di influenzare diversi parametri qualitativi dell'uva e del vino risultante, in particolare, in relazione alla maturazione dell'uva e alla successiva vinificazione.

Per le varietà di uva a bacca bianca, come il Semillon, la sfogliatura può avere effetti diversi rispetto alle uve a bacca rossa. Mentre l'incremento di luce e arieggiamento rimangono vantaggi generali, è stato osservato che la sfogliatura può portare ad un maggiore accumulo di sostanze polifenoliche e ad un aumento della degradazione di sostanze aromatiche, con conseguente perdita di profumi. Questo evidenzia la complessità degli effetti della sfogliatura sulla qualità del vino, dipendendo fortemente dalla varietà di uva e dalle condizioni climatiche. La ricerca si è concentrata sugli effetti della sfogliatura in pre-allegagione su mosti di Semillon, valutando l'impatto di questa pratica sulle caratteristiche qualitative dell'uva e del vino finale, in particolare sulla concentrazione di diversi composti aromatici.

Il Semillon, vitigno a bacca bianca dai riflessi dorati, è un protagonista della viticoltura bordolese, spesso assemblato con il Sauvignon Blanc per vini come il Sauternes. Coltivato anche nel sud della Francia, viene utilizzato per bianchi secchi e dolci. La pianta è vigorosa, a foglia scura, resistente e non soggetta a colatura, ma sensibile al marciume nobile. Il Semillon è ampiamente diffuso in Australia (Hunter Valley), Sud America (Cile e Argentina), America del Nord (costa occidentale), Nuova Zelanda, Israele, Europa Orientale e Sud Africa. I composti aromatici più presenti nei vini Semillon sono: butanoato di etile, 2-metilpropanoato di etile, 3-metil-1-butanolo, 1-esanolo, ottanoato di etile, cis-3-esen-1-olo, 2-feniletanolo, acido esanoico, e gli acidi ottanoico e decanoico. La sua diffusione globale e le sue diverse espressioni aromatiche in base al terroir rendono il Semillon un vitigno di grande interesse per lo studio della composizione chimica e delle caratteristiche organolettiche del vino.

Il Fiano è considerato uno dei migliori vitigni a bacca bianca italiani, coltivato principalmente in provincia di Avellino, ma diffuso anche in Puglia e Sicilia. Il nome sembra derivare da una popolazione ligure. Documentato fin dall'Ottocento in Irpinia, Caserta, Puglia e Basilicata, il Fiano produce vini di grande complessità, finezza aromatica e capacità di invecchiamento (es. Fiano di Avellino DOCG). Sebbene l'uva Fiano non sia particolarmente ricca di composti aromatici liberi, presenta elevate concentrazioni di precursori aromatici glicosilati. Durante la vinificazione e l'invecchiamento (circa 24 mesi), questi precursori vengono rilasciati grazie a processi idrolitici enzimatici e acidi, esprimendo il potenziale aromatico del vitigno. Tra i glicosidi principali troviamo linalolo, geraniolo, 4-vinilguaiacolo, β-damascenone, 1,1,6-trimetil-1,2-diidronaftalene (TND), e altri. Il linalolo e il geraniolo sono responsabili del carattere floreale, mentre tra i composti aromatici liberi predominano alcoli isoamilici, 2-feniletanolo, 4-vinilguaiacolo, butanoato di etile e esanoato di etile. L'analisi della composizione aromatica del Fiano evidenzia la complessa interazione tra precursori e composti liberi, con un'evoluzione significativa durante il processo di invecchiamento.

L'analisi dei composti volatili nel vino è stata eseguita principalmente tramite Gas Cromatografia-Spettrometria di Massa (GC/MS). Questa tecnica, che combina la separazione dei componenti tramite GC con l'identificazione e la quantificazione tramite MS, offre una sensibilità maggiore rispetto ai detector tradizionali della GC, consentendo l'identificazione dei singoli composti volatili. Nello specifico, è stato utilizzato uno strumento Hewlet-Packard (Palo Alto, CA, USA) composto da un gascromatografo HP 5890, un sistema di iniezione HP 6890 Series Injector e uno spettrometro di massa HP 5971. La colonna utilizzata era capillare in silice fusa HP Innowax (Supelco, Milano). Il database CRA-VIT (Consiglio di Ricerca in Agricoltura –Sezione Viticoltura – Conegliano –TV), contenente gli spettri di massa degli aromi di uve e vini, è stato impiegato per l'identificazione dei composti volatili, permettendo uno studio comparativo dei profili aromatici di mosti di Semillon provenienti da viti sfogliate e non sfogliate. L'utilizzo di uno standard interno (1-eptanolo) ha consentito una determinazione semi-quantitativa dei composti. La tecnica GC/MS si è dimostrata particolarmente efficace per l'analisi di composti volatili liberi e di quelli ottenuti tramite idrolisi enzimatica da precursori aromatici glicosilati.

Oltre alla GC/MS, è stato utilizzato il metodo UHPLC/QTOF (Ultra High Performance Liquid Chromatography/Quadrupolo-Tempo di Volo), applicato per la prima volta all'analisi dei vini in questo studio. Questa tecnica, più avanzata rispetto alla GC/MS, è stata sviluppata per lo studio dei terpenoli glicosilati nelle uve. L'utilizzo di un analizzatore ad alta risoluzione QTOF ha permesso di identificare 14 terpenoli glicosidi senza ricorrere all'idrolisi enzimatica, consentendo una parziale identificazione della natura degli zuccheri legati ai composti aromatici. In particolare, sono stati differenziati i derivati pentosil-esosidi ed i ramnosil-esosidi. L'alta risoluzione del QTOF ha ridotto il numero di possibili formule brute associabili ai segnali, diminuendo il rischio di false attribuzioni di composti isobarici. Questa tecnica rappresenta un significativo avanzamento nelle capacità analitiche per lo studio della composizione aromatica del vino, offrendo una maggiore precisione e dettaglio nell'identificazione dei composti presenti.

L'estrazione in fase solida (SPE), menzionata nel documento, è descritta come un processo fisico di adsorbimento tra una fase solida e una fase liquida. La fase solida, con maggiore affinità per gli analiti rispetto al solvente, concentra gli analiti sulla sua superficie mentre gli altri composti eluiscono. Questo processo di purificazione e concentrazione sfrutta interazioni specifiche tra i gruppi funzionali dei composti e il substrato della fase solida. La fase solida adsorbente è impaccata in una cartuccia, attraverso cui passa il campione. La ritenzione degli analiti dipende dal tipo di adsorbente e dal solvente. L'eluizione, ovvero la rimozione degli analiti dall'adsorbente, avviene mediante il passaggio di un opportuno solvente, in un volume minimo. Una maggiore interazione tra adsorbente e analita riduce il rischio di perdita durante le fasi di lavaggio. Il volume di solvente necessario per l'eluizione è un parametro chiave per valutare l'efficienza del processo.

Tra gli adsorbenti più utilizzati nell'estrazione in fase solida (SPE) vi sono gli adsorbenti silicei, prodotti dalla reazione tra organosilani e silicati attivi. Questi sono stabili a pH tra 2 e 7,5 e compatibili con la maggior parte dei solventi organici. La loro rigidità e la mancanza di rigonfiamento in presenza di solventi permettono l'utilizzo di diversi solventi in sequenza, rendendo possibili estrazioni complesse. Le particelle di adsorbente, di dimensioni variabili tra 15 e 100 µm, permettono un flusso rapido del solvente. La porosità (circa 60 Angstroms) è adatta a composti con peso molecolare attorno a 15.000. Le proprietà di ritenzione degli adsorbenti silicei dipendono dai gruppi funzionali legati alla silice, dalla polarità del substrato e dai silanoli liberi. Interazioni secondarie tra substrato e analita variano in funzione della polarità, influenzando la formazione di legami idrogeno o interazioni ioniche. La selettività è massima quando l'adsorbente interagisce solo con i gruppi funzionali specifici dell'analita.

Le interazioni nell'estrazione in fase solida (SPE) possono essere di tipo polare (legami idrogeno, forze dipolo-dipolo) o non-polare. Le interazioni polari avvengono tra gruppi funzionali polari dell'analita (come -OH, -NH₂, C=O, anelli aromatici) e gruppi funzionali polari dell'adsorbente. I legami idrogeno sono interazioni polari comuni, favorite da solventi non-polari e rotte da solventi polari durante l'eluizione. Le interazioni non-polari sono invece facilitate da solventi polari e rotte da solventi non-polari nell'eluizione. La solvatazione dell'adsorbente, necessaria prima del passaggio del campione, avviene con solventi polari (es. metanolo) per preparare l'adsorbente all'interazione con gli analiti. La scelta del solvente è quindi cruciale per ottimizzare sia la ritenzione che l'eluizione dei composti di interesse, garantendo l'efficacia dell'estrazione in fase solida (SPE).

L'analisi GC/MS-EI, combinata con l'utilizzo dei database di spettri di frammentazione NIST ed ESTRATTI, ha dimostrato un'elevata potenzialità nell'identificazione dei composti volatili nei mosti e nei vini. L'analisi ha incluso sia i composti volatili liberi che gli agliconi prodotti per idrolisi dei composti glicosilati. La determinazione semi-quantitativa dei composti, effettuata utilizzando uno standard interno, ha consentito uno studio comparativo dei profili aromatici dei mosti di Semillon da viti sfogliate e non sfogliate. Questa analisi ha evidenziato che la sfogliatura influenza positivamente la biosintesi di terpenoli liberi e norisoprenoidi glicosilati. Tuttavia, per gli alcoli e i composti benzenoidi liberi e glicosilati, le variazioni sono state maggiormente influenzate dall'andamento climatico dell'annata, dimostrando l'interazione tra fattori agronomici e climatici sulla composizione aromatica del vino.

In questo studio, è stato applicato per la prima volta l'analisi UHPLC/QTOF all'analisi dei vini, metodo precedentemente sviluppato per lo studio dei terpenoli glicosilati nelle uve. Questo metodo si è rivelato particolarmente efficace nell'identificazione di 14 terpenoli glicosidi, evitando l'idrolisi enzimatica. L'analizzatore ad alta risoluzione QTOF ha consentito una parziale identificazione della natura degli zuccheri legati al composto aromatico, differenziando i derivati pentosil-esosidi ed i ramnosil-esosidi. La maggiore risoluzione ha limitato il numero di formule brute associabili ai segnali, riducendo la possibilità di false attribuzioni dovute a composti isobarici. L'utilizzo di questa tecnica ha permesso di approfondire la conoscenza della composizione e del profilo aromatico del vino, ampliando le potenzialità analitiche rispetto alle tecniche tradizionali.